Farmacia. Biomedicina. CITOMETRÍA de FLUJO. Nuevo Dispositivo Altamente Eficiente

El nuevo diseño del dispositivo aporta una confianza sin precedentes a las mediciones de células
Las mediciones de incertidumbre directa ahora son posibles en la citometría de flujo.

julio 20, 2022

El chip del citómetro tiene aproximadamente 25 mm de ancho y 50 mm de largo (aproximadamente 1 x 2 pulgadas). Los dos puntos azules brillantes son los puntos donde las partículas en el fluido son iluminadas por la luz láser. Dos señales de salida de fluorescencia de cada punto son transportadas por conexiones de fibra a la derecha. Hay cinco entradas en la parte superior del chip: una para la muestra y cuatro para crear la vaina de fluido.
Crédito: G. Cooksey/NIST

 

Medir el número y las propiedades de las células que se mueven en una corriente, un proceso llamado citometría de flujo, es de importancia crítica para la medicina de diagnóstico, la investigación farmacéutica y la ciencia biomédica. Ahora, los investigadores del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) han ideado una forma de hacer mejoras sin precedentes en la técnica.

La citometría de flujo generalmente implica marcar las células con material fluorescente, hacer brillar la luz láser sobre ellas a medida que cruzan un punto en particular en un canal de fluido del tamaño de un cabello humano, lo suficientemente estrecho como para que las células generalmente se muevan en un solo archivo, y registrar la luz emitida por los marcadores en la célula. El análisis de las emisiones revela varias características, como el tipo de célula, el tamaño, el contenido de ADN y la etapa en el ciclo de división celular.

Pero el método convencional de medición única carece de un medio para cuantificar las variaciones en sus lecturas. Por ejemplo, un citómetro que mide los biomarcadores del cáncer puede usar un valor de medición específico para decidir entre células sanas o enfermas. Una célula puede devolver un valor ligeramente más bajo, identificándola como saludable. Pero se desconoce el rango de valores que el instrumento podría devolver para mediciones repetidas de esta celda.

Eso es problemático porque no se sabe con qué frecuencia el valor podría tergiversar el diagnóstico. Por ejemplo, una alta confianza es imperativa al contar las células tumorales circulantes, que conducen a la metástasis del cáncer; puede haber solo una célula tumoral por cada millón de otras en una muestra de sangre. Mejorar la capacidad de resolver estos eventos raros podría conducir a una detección más temprana y mejores opciones de tratamiento.

Del mismo modo, los recuentos imprecisos de diferentes poblaciones celulares, como las células inmunes, en una muestra pueden conducir a un diagnóstico incorrecto de la enfermedad o a una mala interpretación de si un tratamiento farmacológico fue exitoso. Puede ser difícil saber si las diferentes mediciones surgen de distintos tipos de células o simplemente de la variabilidad experimental.

Para abordar esa situación, los investigadores del NIST crearon y validaron un nuevo sistema que registra directamente la cantidad de variación en las mediciones de citometría de flujo para cuantificar la incertidumbre. Su instrumento hace una serie de lecturas múltiples de la misma partícula cuya posición y velocidad se controlan exactamente a medida que se mueve en el canal, lo que les permite observar variaciones dependientes de la medición tan bajas como el 1%.

«Esta es la primera vez que podemos medir directamente la incertidumbre por objeto en un citómetro de flujo», dijo Matthew DiSalvo, autor principal del equipo del NIST que informó sus resultados el 20 de julio de 2022, en la revista Lab on a Chip. «Cuando se mide algo una vez, y solo una vez, no se puede verificar la precisión», dijo. «Para hacerlo, necesitas repetibilidad».

El nuevo citómetro de flujo en serie a escala de chip aborda este problema realizando cuatro mediciones de cada partícula: dos lecturas en cada uno de los dos puntos diferentes separados por 16 milímetros; (aproximadamente 0.6 pulgadas) en el canal con caudales tan altos como 100 o más partículas por segundo.

Varios desafíos críticos tuvieron que ser superados para crear el nuevo citómetro, que inicialmente se probó utilizando perlas de plástico uniformes de aproximadamente 15 micrómetros (μm, millonésimas de metro) de diámetro, alrededor de una décima parte del ancho de un cabello humano y el mismo tamaño que los glóbulos blancos promedio.

Uno de los desafíos fue fabricar un canal (aproximadamente 40 μm por 80 μm) que incorporara dos zonas idénticas en las que se aplicó luz láser a la partícula que pasaba y garantizar que la mayor cantidad de luz fluorescente emitida fuera capturada por un par de detectores que midieran tanto en dirección ascendente como aguas abajo. Para hacerlo, DiSalvo y el líder del proyecto Gregory Cooksey desarrollaron guías de onda avanzadas que minimizaron la pérdida y evitaron que la luz de emisión se extendiera. Cooksey tiene una amplia experiencia en diseños pioneros para microfluidos, y el equipo de citómetros se basó en ese cuerpo de trabajo.

SEGUNDA IMAGEN     Diagrama esquemático del canal fluido. Cada partícula de muestra se dirige a su posición de equilibrio descentrada antes de viajar por el canal. En dos puntos separados a 16 mm de distancia, un haz de luz láser (488 nm, azul) irradia la partícula y su emisión fluorescente (520 nm, verde) es capturada por detectores (numerados del 1 al 4) en direcciones aguas arriba y aguas abajo.
Crédito: NIST
Otro desafío, particularmente exigente, fue encontrar una manera de garantizar que las emisiones registradas en cada una de las dos zonas del canal provinieran de la misma partícula. Eso solo se podía hacer controlando la posición y la velocidad de la partícula de manera tan exacta que el tiempo de tránsito de un nodo a otro se conociera con precisión, lo que permitía al sistema hacer coincidir las mediciones en el primer nodo con las del segundo.

Para ello, los investigadores desarrollaron una técnica «híbrida» para enfocar la partícula en un punto específico del canal. En los citómetros convencionales, esto generalmente se hace mediante el uso de dos bombas de fluido diferentes: una para inyectar las partículas y otra para crear una vaina separada de fluido alrededor del perímetro interior del canal, en efecto formando un tubo líquido dentro del canal sólido. Que actúa para confinar la muestra en el núcleo central del canal.

O, al menos, esa es la presunción. Pero, de hecho, dijo Cooksey, en canales pequeños «ese es el peor lugar posible donde podrías ponerlo».

La razón es que la inercia del fluido en pequeños canales añade dos fuerzas sobre la partícula. Una fuerza actúa para levantar la partícula lejos de la pared. Pero otra fuerza empuja la partícula lejos del centro del canal debido a la diferencia en la velocidad del fluido que actúa a ambos lados de la partícula. Como resultado, la partícula tiende naturalmente a moverse fuera del centro a una posición de equilibrio en la que las fuerzas están equilibradas. Para el diseño específico utilizado en este estudio, el desplazamiento desde la línea central varía con la velocidad del fluido, desde aproximadamente 11 μm a 0,75 metros por segundo hasta 14 μm a 1,35 m/s.

Para controlar esa posición con mucha precisión, DiSalvo y Cooksey utilizaron cuatro bombas para impulsar la vaina, lo que les permitió ajustar las presiones de lado a lado, así como hacia arriba y hacia abajo. «Usamos la hidrodinámica para poner la partícula en la posición a la que sabemos que quiere ir al comienzo de su tránsito», dijo DiSalvo. «Entonces, cuando una partícula acelera por el canal, ya está en su posición de equilibrio. Eso se mantiene muy bien durante toda la longitud del citómetro».

En consecuencia, el dispositivo es capaz de realizar mediciones de alta precisión con las partículas moviéndose a una velocidad de alto rendimiento de 1 m / s. (1 m / s, o aproximadamente 2.3 mph, puede parecer lento. Pero a esa velocidad, una partícula de 10 μm se mueve 100.000 veces la longitud de su cuerpo por segundo. Un automóvil que hace eso estaría viajando alrededor de 1 millón de mph).

Desde que los experimentos fueron reportados en el nuevo artículo de la revista, el equipo ha estado midiendo los glóbulos blancos en el dispositivo. «Lo primero que hemos estado observando es dónde está la célula en su ciclo de división», dijo Cooksey. «Estamos observando cuánto ADN hay en la célula. La señal fluorescente nos permite cuantificar cuántas de las células están activamente en el proceso de división, sometiéndose a la síntesis de ADN».

Los investigadores también están utilizando diferentes longitudes de onda láser para revelar diferentes propiedades de la muestra.

«Hemos modificado ampliamente las guías de onda para aumentar la sensibilidad mediante la incorporación de microlentes y otras mejoras», dijo DiSalvo. «Creemos que pronto podremos proporcionar mediciones de incertidumbre al tiempo que igualamos la sensibilidad de los sistemas comerciales de medición única que cuestan cientos de miles de dólares».

El proyecto citómetro incluye colaboradores con experiencia en matemáticas y modelado, lo que lleva a nuevos métodos analíticos adicionales que mejorarán la cuantificación y clasificación. Los investigadores del NIST Paul Patrone y Anthony Kearsley han estado utilizando el análisis de señales para separar las variaciones de medición debido a las variaciones de flujo y el tamaño de las partículas. Sus métodos también permiten una capacidad incomparable para identificar y separar objetos que anteriormente habrían estado demasiado juntos para distinguirlos en una medición convencional. La falta de distinción de objetos separados impide la precisión en el conteo y podría provocar la falta de componentes únicos de la muestra, como las células tumorales circulantes o las células inmunes que interactúan.

 

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